来源：EngineeringForLife
关节软骨作为无血管组织，自我修复能力极差，不仅会引发疼痛、关节功能障碍，甚至可能导致永久性残疾。损伤部位活性氧簇 (ROS)
积聚会加重炎症反应，进一步阻碍愈合进程。干细胞疗法是潜力解决方案，其中滑液来源间充质干细胞 (SF-MSCs)
因其易获取、强成软骨分化能力而具有广泛前景，但依然存在注射易受损、移植后易纤维化等问题，故亟需开发合适的微创注射载体。
水凝胶因其高含水量、可调力学性能、良好的生物相容性和生物降解性，已成为理想的干细胞递送载体。然而，传统块状水凝胶存在营养供应不足、难用于微创治疗等问题，促使研究者转向具有大比表面积等特点的微球系统。传统微球制备技术（如批量乳化法）存在产量低、细胞存活率不高等问题。相比之下，投影式光固化（DLP）生物3D打印技术可高效、均一地制备微球，更好地保障细胞与药物活性。基于此开发的生物活性微球系统，为SF-MSCs提供了适宜的生长环境，有望有望突破其临床应用瓶颈。 论文题目：3D printing programmed diagnostic and therapeutic
bioactive“all-in-one”microspheres with multistimuli responsiveness for
cartilage regeneration
DOI：10.1016/j.cej.2025.163898
发表期刊：Chemical Engineering Journal ( IF 13.2 )
投影式光固化生物3D打印机
本研究开发了一种生物活性 “一体化” 微球 (MSs) 系统，用于微创软骨再生。该团队采用新型投影式光固化(DLP)生物3D打印技术，以
GelMA/HANB/TA 为仿生生物墨水，整合滑液来源间充质干细胞(SF-MSCs)
和负载软骨生成素(KGN)的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒制备微球。该技术可在几秒内批量打印数千个微球，无剪切力影响且细胞存活率高，微球兼具病理信号“诊断”和药物缓释“治疗”双重逻辑，还具备组织粘附、抗氧化、抗炎特性，能通过CCN1/CYR61介导的integrin/PI3K/Akt信号通路促进
SF-MSCs软骨分化，延长关节滞留时间（图1）。
主要内容
GelMA/HANB/TA水凝胶生物墨水中的单宁酸 (TA) 具有优异的自由基清除能力，对 ABTS+・、DPPH・和超氧阴离子自由基
(O₂・⁻) 的清除效率均较高。在过氧化氢 (H₂O₂) 模拟的氧化应激环境中，该水凝胶能有效保护 SF-MSCs 存活，细胞存活率达
94.94±2.57%，且能减少细胞内 ROS 积累、维持线粒体膜电位稳定。同时，它可调控巨噬细胞表型转换，显著增加 M2 型巨噬细胞标志物
CD206 的表达，降低 M1型标志物 CD86 的表达，还能抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素 -1β(IL-1β) 和白细胞介素
– 6(IL-6) 等促炎因子的分泌，提高抗炎因子白细胞介素 -10(IL-10) 的水平，展现出良好的免疫调节和抗炎效果（图2）。
通过DLP生物3D打印技术，以GelMA/HANB/TA为生物墨水，经紫外光照射快速交联，采用“自下而上”的层叠打印方式，几秒内即可制备数千个尺寸均一的微球。打印微球可定制300
μm、400 μm和500 μm等不同直径，直径偏差最大不超过10%。通过乳液法合成的负载KGN的PLGA纳米颗粒呈球形，平均直径230
nm，将其均匀混入生物墨水中打印形成“一体化”微球后，KGN
的封装效率虽有下降，但能实现长效缓释，避免突释现象，为软骨再生提供持续的生物活性信号（图3）。
从骨关节炎患者滑液中分离的SF-MSCs，经鉴定表达CD90、CD105、CD73等干细胞标志物，且具有三系分化潜能。将其负载于“一体化”微球后，在体外培养21天期间细胞生长增殖良好，存活率始终保持在95%以上，细胞能在微球内形成空间分布。与不含KGN的微球组相比，负载KGN的微球组(MSs@SF-MSCs@KGN)能显著上调软骨分化关键标志物Ⅱ型胶原蛋白(COL2)和性别决定区Y框蛋白9(SOX9)的表达，同时增加胶原蛋白和糖胺聚糖(GAG)
的积累，明确证明KGN能有效诱导SF-MSCs向软骨细胞分化（图4）。
打印微球具有良好的生物相容性，SF-MSCs能快速粘附在微球表面并持续增殖，细胞数量随培养时间逐渐增加。在Transwell共培养体系中，SF-MSCs的存活率始终保持在95%以上，证实微球对细胞无毒性。伤口愈合实验和Transwell迁移实验结果显示，MSs@SF-MSCs@KGN组的细胞迁移速度显著快于对照组和不含KGN的微球组，表明该微球系统能有效招募宿主细胞向软骨缺损部位迁移，为组织修复提供充足细胞来源（图5）。
体外软骨分化诱导实验中，MSs@SF-MSCs@KGN组的SF-MSCs经 Safranin O和Alcian
blue染色后，阳性信号显著强于其他两组，表明软骨基质合成更为丰富。免疫荧光染色结果显示，该组细胞中COL2和SOX9的荧光强度明显升高，实时荧光定量PCR
(RT-qPCR)
检测进一步证实COL2、SOX9和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)等软骨分化相关基因的表达水平显著上调，充分说明微球缓释的KGN能有效促进SF-MSCs的软骨分化（图6）。
转录组测序(RNA-seq)分析显示，与2D培养相比，SF-MSCs在微球系统(尤其是负载KGN的微球系统)
中出现大量差异表达基因(DEGs)，这些基因主要富集在细胞粘附、细胞外基质组织、细胞增殖调控等生物学过程。KEGG通路分析表明，PI3K-Akt信号通路、focal
adhesion等通路被显著激活。WB验证显示，MSs@SF-MSCs@KGN组中CCN1/CYR61、磷酸化PI3K(p-PI3K)
、磷酸化 Akt(p-Akt)的蛋白水平显著升高，同时COL2和SOX9的表达也明显上调，证实微球通过CCN1/CYR61介导的下游
integrin/PI3K/Akt信号通路促进 SF-MSCs软骨分化（图7）。
荧光成像技术追踪显示，经Cy5.5标记的 “一体化”
微球注射到大鼠关节腔后，能持续滞留长达25天，而单纯注射的SF-MSCs在7天后荧光信号即显著减弱。对大鼠主要脏器的离体荧光成像结果表明，微球主要集中在关节腔部位，全身分布较少，这一特性保证了KGN在关节局部的长效缓释，为软骨修复提供持续的治疗效果（图8）。
在新西兰大白兔膝关节骨软骨缺损模型中，术后6周和12周的大体观察显示，MSs@SF-MSCs@KGN组的缺损部位被光泽洁白的组织充分填充，与周围正常组织整合良好，国际软骨修复学会(ICRS)评分显著高于对照组和不含KGN的微球组。micro-CT扫描和三维重建结果显示，该组缺损区域的新生骨体积(BV)
、骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)均显著增加，骨小梁分离度(Tb.SP)
降低，表明微球能有效促进软骨下骨再生，为软骨修复提供良好的力学支撑（图9）。
组织学染色结果显示，MSs@SF-MSCs@KGN组术后12周的修复组织经Safranin O和Alcian
blue染色呈强阳性，GAG含量显著高于其他两组，且Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色阳性细胞大量聚集，修复组织与正常软骨界面无缝整合，改良
O’Driscoll组织学评分(MODS)最高。生物力学测试表明，该组修复软骨的应力值、弹性模量和硬度均显著高于对照组，且接近正常软骨水平，具备承受外界压力的力学性能，满足生理功能需求（图10）。
未来展望
3D打印与生物活性“一体化”微球的结合，为骨修复带来革命性前景。3D打印的快速批量生产、尺寸精准可控优势，让微球能按需定制直径与性能，适配不同关节软骨缺损及力学需求，还可整合自体干细胞实现个性化制备。微球则凭借干细胞递送、药物长效缓释、抗炎抗氧化等功能，协同促进软骨-软骨下骨同步再生，通过微创注射即可完成治疗。两者联用既打破传统骨修复创伤大、效果有限的瓶颈，又能推动骨关节炎、创伤性骨软骨缺损等疾病的精准治疗，加速微创化、定制化骨修复方案的临床转化，成为再生医学领域的核心突破方向。
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