来源：EFL生物3D打印与生物制造
长骨骨折可通过膜内成骨与软骨内成骨修复非临界骨缺损，但临界尺寸长骨缺损无法自愈，易出现骨不连，现有自体/异体/人工植骨均存在供体损伤、排异、整合差等局限。因此组织工程转向发育工程学策略，即模拟体内软骨内骨化过程，先形成软骨痂再逐步转化为骨，而体外重现这一过程需精准调控三维微环境，极具挑战。人骨膜来源干细胞（hPDCs）增殖与成骨、成软骨能力优于骨髓/脂肪干细胞，是骨再生理想细胞，将其制成细胞球聚体可模拟软骨痂形成的早期关键步骤。球聚体适合作为生物打印“组装单元”，而挤出式生物打印可实现高密度、规模化制备富细胞组织支架。
论文题目： Packed for Ossification: High-Density Bioprinting of hPDC Spheroids in HAMA Toward Endochondral Ossification
DOI： 10.1002/adhm.202505855
发表期刊： Advanced Healthcare Materials
本研究构建了将人骨膜源性干细胞球高密度包裹或生物打印于甲基丙烯酸化透明质酸水凝胶的组织工程方案，用于支持软骨形成以实现软骨内骨再生。在第1、7、14天不同时间点包裹实验显示，早期包裹能增强细胞球相互作用、提升DNA含量、促进肥大软骨形成与糖胺聚糖、胶原沉积及腔隙结构产生。将HAMA包裹细胞球与微孔板培养细胞球对比发现，包裹体系可支持软骨样基质形成并维持肥大表型进程，基因表达与免疫荧光结果证实其向肥大与成骨表型分化。最终基于HAMA的高密度hPDC细胞球挤压生物打印实现了可放大制备，同时保持细胞活性与肥大分化能力，仅细胞球空间精准定位仍需优化。
该图完整呈现了不同时间包裹hPDC细胞球的实验设计与核心结果，研究者在细胞球形成后第1、7、14天分别包裹进HAMA水凝胶并培养至21天，通过明场成像观察到第1天和第7天包裹的细胞球出现明显的相互接触与融合结构，第14天包裹组无明显胞间作用。活死染色结果显示所有包裹组细胞均保持高存活率，无明显死亡信号，定量数据进一步证明第1天包裹的细胞球在21天时DNA含量显著更高，而各组总糖胺聚糖含量与单位DNA糖胺聚糖水平无统计学差异，证实早期包裹更利于细胞增殖与球间融合（图1）。
图 1 细胞球包裹时间点优化研究
此图系统展示了不同包裹时间点细胞球的组织学染色与免疫荧光结果，苏木精-伊红、阿尔辛蓝、番红O、天狼星红染色结果显示，第1天包裹组出现清晰的软骨腔隙结构，胶原纤维信号在偏振光下更明显，糖胺聚糖沉积均匀分布。免疫荧光染色显示所有组别均有成骨分化关键因子Osterix的阳性表达，说明细胞均向肥大软骨与成骨方向分化，其中第1天包裹组的组织形态更规整，基质成熟度更高，进一步验证早期包裹为最优条件（图2）。
图 2 不同包裹时间细胞球组织学与免疫荧光表征
全面对比了微孔板培养与HAMA包裹两种体系下细胞球的生长与分化差异，明场图像显示HAMA包裹的细胞球体积明显更大，形态不规则且出现大量球间融合，而微孔板细胞球保持规则圆形。活死染色证实两种体系在第1天和第21天均维持高细胞活力，定量分析显示HAMA包裹组细胞球截面积在7、14天显著大于微孔板组，圆度与紧实度在中期明显下降，DNA含量在21天时显著升高，同时两组均大量分泌并保留糖胺聚糖基质，证明HAMA环境更利于细胞生长与基质积累（图3）。
图 3 微孔板与HAMA包裹细胞球分化对比
基于共聚焦成像与机器学习对细胞球形态进行深度分析，通过主成分分析将所有细胞球分为三个独立集群，其中集群0全部为第1天的早期细胞球，集群1包含后期微孔板与HAMA细胞球，集群2仅由HAMA包裹的7、14天细胞球组成。形态定量结果显示集群2细胞球面积最大、圆度与紧实度最低，呈现出独特的突起状延伸形态，这一结果直观证明HAMA水凝胶微环境可诱导细胞球发生特异性形态重塑，促进细胞迁移与基质重构（图4）。
图 4 细胞球形态聚类分析
追踪了两种培养体系下细胞球从1天到21天的基质发育过程，阿尔辛蓝染色显示两组均随时间增加糖胺聚糖沉积，HAMA包裹组在14天后凝胶内部也出现基质富集。天狼星红染色与偏振光成像显示胶原纤维逐渐增多并有序排列，番红O染色仅在HAMA包裹组21天出现明显阳性信号，同时该组出现典型的软骨腔隙结构，而微孔板组始终未观察到腔隙，说明HAMA包裹能显著促进软骨基质成熟与肥大化进程（图5）。
图 5 两种培养体系细胞球组织学动态变化
呈现了软骨内骨化关键转录因子的动态表达规律，SOX9作为早期软骨发生标志，在微孔板组仅1、7天呈阳性，而HAMA包裹组可持续表达至14天，延长了软骨分化阶段。成骨与肥大分化关键因子RUNX2和Osterix在两组中均从7天开始稳定表达，直至21天仍保持强阳性，说明两种体系均可驱动细胞从软骨分化逐步转向肥大与成骨表型，且HAMA体系能更好维持软骨分化微环境，延缓过早成骨（图6）。
图 6 软骨与成骨转录因子表达动态
精准定量了软骨内骨化关键基因的表达时序，微孔板组中聚集蛋白聚糖在14天达到峰值，II型胶原在21天最高，X型胶原、骨桥蛋白等肥大成骨基因随时间持续上调。HAMA包裹组聚集蛋白聚糖持续升高至21天，II型胶原在7天达峰后维持稳定，X型胶原与成骨基因同样稳步上升，两组基因表达均符合软骨内骨化的自然发育时序，且HAMA组更有利于长期软骨基质合成与平稳过渡到肥大分化阶段（图7）。
图 7 软骨与成骨相关基因表达定量
呈现了软骨内骨化关键转录因子的动态表达规律，SOX9作为早期软骨发生标志，在微孔板组仅1、7天呈阳性，而
HAMA
包裹组可持续表达至14天，延长了软骨分化阶段。成骨与肥大分化关键因子RUNX2和Osterix在两组中均从7天开始稳定表达，直至21天仍保持强阳性，说明两种体系均可驱动细胞从软骨分化逐步转向肥大与成骨表型，且HAMA体系能更好维持软骨分化微环境，延缓过早成骨（图8）。
图 8 高密度生物打印细胞球构建体表征
总结及展望
本研究证实了将hPDC细胞球与HAMA结合进行高密度生物打印，是构建肥大软骨结构用于骨再生的可行规模化策略。实验观察到的细胞球部分融合、细胞外基质沉积以及软骨向成骨分化的进程，证明该方案可生成适用于大段骨缺损修复的肥大软骨模板。HAMA为早期细胞球融合与肥大软骨形成提供了良好微环境，这是推动该策略向临床适用骨移植物转化的关键。挤压式生物打印实现了hPDC细胞球的高密度排布与结构化构建，突破传统细胞培养的形态限制，让骨修复支架具备可放大、可定制化的临床转化潜力。本研究展望未来将优化生物打印的空间精准控制，结合血管化策略，并通过体内实验验证修复效果，最终开发可临床应用的模块化骨再生支架。
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